文章出處：
中國組織工程研究 第16卷 第35期 2012-08-26初版
齊進(jìn)，黃萍，張連方，豐盛梅，鄧廉夫
文章亮點(diǎn)：
①采用EXAKT切磨系統技術(shù)能制作出高質(zhì)量的軟、硬組織薄層切片。
②EXAKT 切磨系統可清晰顯示各種組織結構和人工植入物。
文章概要: 
實(shí)驗對做形態(tài)計量觀(guān)察的骨標本和含金屬植入物的軟硬組織標本采用不脫鈣有機玻璃包埋技術(shù)進(jìn)行處理。實(shí)驗采用EXAKT硬組織切磨系統制作皮質(zhì)骨和含金屬植入物的軟硬組織切片，能獲得厚薄均一的5-10μm薄切片。實(shí)驗發(fā)現EXAKT硬組織切磨系統制作的薄切片在高倍鏡下更容易聚焦，可清晰顯示組織結構及熒光標記。
背景：
目前常用的Polycut 硬組織切片機難以制作皮質(zhì)骨或含堅硬植入物組織的薄層切片，近年來(lái)這些切片多用EXAKT硬組織切磨系統進(jìn)行制作。
目的：
實(shí)驗采用EXAKT切磨系統制作含金屬內植物的軟、硬組織薄層切片。
方法：
取大鼠股骨遠端、小鼠股骨干骨折部、帶有鈦金合金種植體的犬下頜骨和帶有鈷鉻支架的豬冠狀主動(dòng)脈標本，經(jīng)多聚甲醛固定和丙酮脫水后用有機玻璃（甲基丙烯酸甲酯）浸透包埋。組織包埋塊用EXAKT系統作厚度約300μm的切片，然后磨片至5-10μm的切片。不同切片用蘇木精-伊紅和甲苯胺藍染色后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察形態(tài)。
結果與結論：
甲苯胺藍染色顯示，大鼠股骨遠端骨組織切片中干骺端礦化骨小梁呈淺藍色、皮質(zhì)骨結構完整，無(wú)碎裂。含帶有鈦合金種植體的犬下頜骨切片淺藍色宿主骨與黑色金屬種植體密切結合，形成牢固的界面。四環(huán)素標記的小鼠股骨干骨折部骨痂切片，在熒光顯微鏡（紫外光）下顯示明顯的雙層熒光帶。蘇木精-伊紅染色的包裹鈷鉻合金支架的豬冠狀動(dòng)脈組織切片顯示，支架材料維持原味，與血管壁無(wú)脫離或游離現象，組織無(wú)皺紋或折疊。結果提示，采用EXAKT切磨系統技術(shù)能制作出高質(zhì)量軟、硬組織薄層切片，可清晰顯示各種組織結構和人工植入物。
關(guān)鍵詞：
EXAKT切磨系統；骨；植入物；有機玻璃；切片；骨組織構建

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對含熒光素標記的骨組織常用Polycut硬組織切片機進(jìn)行切片，優(yōu)點(diǎn)是能切5-10μm厚的切片，清晰顯示骨結構和熒光標記[1-3]，缺點(diǎn)是切堅硬的皮質(zhì)骨易發(fā)生骨碎裂，導致切片質(zhì)量較差，并且不能切割金屬植入物。因此，切皮質(zhì)骨和含金屬植入物的骨標本常用Leica菇切片機或慢速金剛環(huán)鋸[4-6]。這些器械切出的切片較厚，常超過(guò)100μm，需要用磨片機甚至手工進(jìn)行磨片[4-6]。這樣摸出的切片厚度不一，甚至產(chǎn)生同意切片不同部位的厚薄不勻，導致鏡下觀(guān)察時(shí)難以聚焦，影響照片質(zhì)量。對于這些常規設備難以制作的硬組織切片，目前多用德國EXAKT硬組織切磨系統進(jìn)行制備[7-9]，這些切片能達到＜20μm的厚度，并保持硬組織，組織與植入物之間的原有組織結構形態(tài)。

實(shí)驗室介紹采用EXAKT硬組織切磨系統制備皮質(zhì)骨及含內植物軟硬組織薄切片的計提方法及可能達到的效果。
1、材料和方法
設計：組織學(xué)實(shí)驗。
時(shí)間及地點(diǎn)：于2008/2011上海市傷骨科研究所實(shí)驗室收集。包括：①3月齡雌性SD大鼠的股骨遠端組織標本。②含四環(huán)素雙標記的3月齡小鼠股骨干骨折部骨痂組織標本。③含鈦合金合金種植體的雄性犬下頜骨組織標本。④含植入鈷鉻合金支架的雄性豬冠狀動(dòng)脈組織標本。
主要試劑和儀器：

方法：
組織固定、脫水和包埋：新鮮組織塊至于40g/L多聚甲醛固定液中固定48h后流水沖洗24h，在EXAKT 510脫水儀中用100%丙酮溶液脫水。脫水后將組織塊植入塑料模具，在EXAK T520光固化包埋機中做有機玻璃包埋。

組織切片：有機玻璃聚合后去除塑料模具，用Technovit 4000黏合劑將有機玻璃包埋樣本黏于載玻片A。將載玻片A真空吸附于EXAKT 300CP切片機夾具上，通過(guò)激光在包埋標本上定位，用金剛鋸條切割暴露標本表面。將載玻片A吸附于EXAKT 400CS磨片機對標本表面進(jìn)行拋光。在EXAKT 401載片黏合裝置張用Technovit 7210VLC膠水將載玻片B合成一個(gè)類(lèi)似于三明治的結構。將三明治結構的載玻片A側吸附于EXAKT 300CP切片機夾具上，從載玻片B側通過(guò)自動(dòng)步進(jìn)定位裝置切割厚度約300μm的切片。

把黏附切片的載玻片B吸附于待滾動(dòng)磨盤(pán)裝置和電子測量控制系統的EXAKT 400CS微磨片裝置，針對不同標本預先設定磨片的厚度。在各級SiC&Al?O?砂紙上磨片至預定厚度，最后用細砂紙對切片表面進(jìn)行拋光。整個(gè)過(guò)程通過(guò)AW100測量控制系統進(jìn)行控制。實(shí)驗的切片最終厚度為5-10μm。
切片染色方法：
蘇木精-伊紅染色：將蘇木精直接滴加于植入鈷鉻支架的豬冠狀動(dòng)脈切片組織表面，視標本類(lèi)型掌握染色時(shí)間，通常5-30min，流水清洗殘留染液后切片植入體積分數1%鹽酸乙醇30S，流水沖洗后再入溫水返藍，而后進(jìn)入伊紅復染1min，自然干燥后直接用BASO病理封固膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察組織形態(tài)。
甲苯胺藍染色：將體積分數1%甲苯胺藍染液直接滴加于大鼠股骨遠端骨組織切片和含帶有鈦合金種植體的犬下頜骨切片表面5-30min(染色時(shí)間視標本類(lèi)型而定)，流水沖洗，待自然干燥后直接用BASO病理封固膠封固。不染色切片直接用BASO病理封固膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各組組織形態(tài)。
采用免疫熒光染色觀(guān)察小鼠股骨骨折骨痂組織形態(tài)，熒光顯微鏡下觀(guān)察組織形態(tài)。
主要觀(guān)察指標：各組染色標本內的顯微結構，不同軟硬組織切片的顯示效果。

2、結果
2.1切片質(zhì)量控制結果 各種骨標本及含內植物的軟、硬組織標本，經(jīng)有機玻璃包埋后，均可通過(guò)EXAKT切磨系統制作出5-10um厚的薄切片。由于磨片厚度經(jīng)螺旋測微器自行測量，因此切片各部位厚度均一(差別不超過(guò)+0.01微米)，且切片表面光整。光鏡下聚焦后各部位結果均能清晰顯示。

2.2不同軟硬組織切片的顯示效果 甲苯胺藍染色的大鼠股骨遠端骨組織切片顯示，切片中干骺端礦化骨小梁呈淺藍色、而未礦化的骨小梁表面類(lèi)骨質(zhì)及骺板軟骨基質(zhì)呈深藍色：淺藍色的皮質(zhì)骨結構完整，無(wú)碎裂，見(jiàn)圖1。

四環(huán)素標記的小鼠股骨骨痂切片(未作其他染色)顯示，在熒光顯微鏡(紫外光)下顯示明顯的雙層熒光帶，據此可測定新骨形成和骨改建，見(jiàn)圖2。

甲苯胺藍染色后的含螺紋狀金屬種植體的犬下頜骨切片顯示，金屬種植體保持在原位，淺藍色宿主骨與黑色金屬種植體密切結合，形成牢固的界面，見(jiàn)圖3。

蘇木精-伊紅染色的包裹鈷鉻合金支架材料的豬冠狀動(dòng)脈組織切片顯示，支架材料維持在原位，與血管壁無(wú)脫離或游移現象，組織無(wú)皺縮或折疊，見(jiàn)圖4。

3、討論
骨是一種堅硬的結締組織，如做石蠟切片，需先進(jìn)行脫鈣。雖然脫鈣骨切片常用于觀(guān)察骨的細胞變化[10]，但脫鈣過(guò)程可引起組織結構皺縮，影響骨結構的定量分析。更重要的是以四環(huán)素為代表的骨熒光標記物與新骨內鈣鹽鰲合[11-12]，脫鈣可使熒光標記消失，影響對骨改建的動(dòng)態(tài)分析。因此，對做形態(tài)計量觀(guān)察的骨標本采用不脫鈣有機玻璃包埋技術(shù)進(jìn)行處理[13-14]。有研究對含金屬植入物的骨標本也采取不脫鈣技術(shù)進(jìn)行處理[15]，主要有2個(gè)原因:①脫鈣不能軟化金屬植入物。②脫鈣引起的骨組織皺縮可引起骨-植入物界面分離，不能反映愈合過(guò)程中植入物與骨的結合情況。
雖然不脫鈣的有機玻璃包埋能夠維持硬組織(骨、牙)和金屬植入物的形態(tài)結構完整性，但切片技術(shù)往往是保證觀(guān)察質(zhì)量的關(guān)鍵。最多用于硬組織切片的是德Polycut硬組織切片機，可切5-10μm的薄切片。除了實(shí)驗研究外，該切片技術(shù)在臨床上廣泛用于髂骨活檢標本[16-17]。
髂骨活檢結果既是診斷骨質(zhì)疏松和多種骨病的金標準，而且也是評判治療效果的重要指標[18]。髂骨活檢前一段時(shí)間服用2次四環(huán)素進(jìn)行新骨雙重標記，使新骨形成區有兩條熒光條帶[17-19]。骨結構和靜態(tài)骨改建參數的測定在甲苯胺藍染色切片上進(jìn)行，而動(dòng)態(tài)骨改建參數依靠在未染色切片上測量四環(huán)素熒光條帶的長(cháng)度和兩條條帶的間距。熒光標記在薄切片中的清晰度遠優(yōu)于厚切片。
然而，Polycut切片機適用于髂骨這類(lèi)含大量松質(zhì)骨和較疏松皮質(zhì)骨的部位[20]，不適合切致密皮質(zhì)骨，更不能切割堅硬的金屬植入物。因此，許多研究采用慢速金剛環(huán)踞切割皮質(zhì)骨或含金屬植入物骨標本[5-6]。但用環(huán)踞切出的切片往往大于100μm，經(jīng)磨片也只能達到50μm，而且磨片厚度不易掌握。這種厚片內的結構較難聚焦，尤其是骨內熒光標記，常會(huì )影響測試的精確性。目前越來(lái)越多學(xué)者用EXAKT硬組織切磨系統制作皮質(zhì)骨和含金屬植入物骨切片[7-9]。該系統對切、磨片厚度均可精確調控，最終片厚可達5-10μm，且厚度均一。實(shí)驗發(fā)現用EXAKT硬組織切磨系統制備的薄層骨切片在顯微鏡下容易聚焦，由于切片各部位厚度均勻，較少出現聚焦困難的現象。因此，即使在高倍鏡下也可顯示清晰的骨結構和熒光標記。此外由于骨結構形態(tài)保持完好，該切片還適用于觀(guān)察金屬內植物與骨的界面情況，這對研究骨內植物的愈合具有重要意義。
對軟組織作顯微鏡觀(guān)察一般采用石蠟切片，但在植入鈷鉻合金支架的情況下石蠟切片不一定適用。原因是石蠟切片刀難以切動(dòng)較硬的合金支架，硬切容易造成支架變形或碎裂。此外，支架和動(dòng)脈組織硬度不一，在切片時(shí)容易造成2者分離。因此需要尋找一種新的方法來(lái)處理這種標本。實(shí)驗對植入鈷鉻合金支架的豬冠狀動(dòng)脈采用硬組織切片方法進(jìn)行處理取得了良好的效果。鏡下顯示支架及動(dòng)脈結構完好，兩者呈密切結合。本次實(shí)驗結果提示對含有金屬材料的軟組織可用有機玻璃包埋方法。有機玻璃浸透可增加軟組織的硬度，在切片時(shí)不易發(fā)生變形。對這種有機玻璃組織包埋塊用 EXAKT硬組織切磨系統制作切片可獲得滿(mǎn)意的觀(guān)察效果。因此，實(shí)驗為觀(guān)察含金屬支架的軟組織提供了一個(gè)有效的方法。
綜上所述，EXAKT硬組織切磨系統適用于制作皮質(zhì)骨和含金屬內植物組織的薄層切片，這種切片可做各種染色進(jìn)行定量組織形態(tài)觀(guān)察，可廣泛應用于骨科、口腔、腫瘤、心血管及整形外科等研究領(lǐng)域。

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