用于骨修復的生物材料及器械在進(jìn)行臨床試驗前均需要進(jìn)行臨床前安全性和有效性動(dòng)物試驗研究，以預測其應用于臨床可能發(fā)生的不良作用[1，2]。骨修復材料的動(dòng)物試驗研究需要制備合適的骨缺損動(dòng)物模型，將骨修復材料植入到制備的骨缺損區域，評價(jià)骨缺損部位的局部炎癥反應、骨整合程度、骨重建情況，對該骨修復材料的安全性及有效性進(jìn)行評價(jià)[3，4]。生物材料及醫療器械動(dòng)物試驗周期結束后，需要剖檢、取樣，切取連帶植入物及其周邊骨組織進(jìn)行病理組織切片制備，以觀(guān)察生物材料及醫療器械與宿主骨組織結合界面的結合情況及其在動(dòng)物體內的吸收降解情況。與普通的石蠟包埋組織切片制備方法相比，埋置有植入物的骨組織標本進(jìn)行組織切片制備時(shí)采用樹(shù)脂包埋病理組織切片制備方法不需要進(jìn)行脫鈣處理，不需要額外剔除組織內埋置的植入物，可完整的觀(guān)察到植入物與宿主骨組織結合界面的組織反應情況，實(shí)現對植入物與骨組織結合界面組織細胞學(xué)變化的研究。本研究對植入了骨修復材料小型豬腰椎椎體不脫鈣病理組織切片制備方法進(jìn)行了研究，以期能為相關(guān)研究人員提供參考。

1.1.1 組織標本

按照《醫療器械動(dòng)物試驗研究注冊審查指導原則第二部分：試驗設計、實(shí)施質(zhì)量保證（2021 年第75 號）》進(jìn)行骨修復材料產(chǎn)品安全性和有效性評價(jià)動(dòng)物試驗研究方案的設計與實(shí)施[5]。試驗研究制備小型豬腰椎椎體骨缺損動(dòng)物模型，將委托方提供的骨修復材料植入到制備的缺損部位，動(dòng)物試驗研究周期結束后獲得了植入了骨修復材料的腰椎椎體骨組織標本。

1.1.2 主要試劑及儀器設備

主要試劑：
10 %中性福爾馬林溶液（購自濟南百博生物技術(shù)股份有限公司），無(wú)水乙醇（購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司），蘇木精染液、伊紅染液及甲苯胺藍染色試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司），Technovit 7200 光聚樹(shù)脂（購自德國EXAKT 公司）。

主要儀器設備：
E300CP 型硬組織切片機、E400CS 型硬組織磨片機、E402 型平行粘片裝置、E510 型脫水浸潤儀、E520 型光固化包埋機、E530 型干燥滲透聚合裝置、E312 型骨組織病理切割機（德國EXAKT公司）。

骨組織標本采用石蠟包埋法進(jìn)行病理切片制作時(shí)，必須先用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、硝酸、甲酸等脫鈣液對骨組織標本進(jìn)行脫鈣處理[6-8]。在骨組織內埋置有植入物的情況下石蠟包埋組織切片并不適用，原因是硬化后的石蠟雖具有一定的硬度，但其硬度不足以支撐去切組織內包埋的植入物，切片過(guò)程會(huì )造成蠟塊碎裂[9-11]。

樹(shù)脂包埋法制備病理組織切片與常規" 石蠟包埋組織切片" 相比，制片步驟更為復雜繁瑣，制片周期更長(cháng)，組織標本需要歷經(jīng)組織切割暴露切面、梯度乙醇脫水、不同體積比的Technovit 7200VLC 樹(shù)脂/乙醇混合液浸潤、光聚合包埋、制備平行粘片，切片、磨片，才可制備出一張不脫鈣的骨組織病理切片。

上述報道的骨組織病理切片制備方法所適用的病理染色方法少，這是其缺陷所在，造就了適用范圍受限。同時(shí)，這種方法制備病理切片周期長(cháng)，僅組織標本的浸潤處理過(guò)程就需要近40天。其優(yōu)點(diǎn)是骨組織制片過(guò)程中不需要脫鈣處理，組織在埋置有植入物的情況下，不需要剔除植入物，這是" 石蠟包埋組織切片" 所實(shí)現不了的，上述報道的骨組織病理切片制備方法可作為傳統的、經(jīng)典的" 石蠟包埋組織切片技術(shù)方法" 的補充。

利用該技術(shù)方法制備含骨修復材料腰椎椎體不脫鈣病理組織切片時(shí)，需注意以下細節：

（1）若切取的骨組織標本體積較大，應延長(cháng)固定時(shí)間且固定過(guò)程中，應多次更換新的固定液，骨組織標本經(jīng)骨組織病理切割機分切后，應該繼續固定至少12 h，以使組織標本得到充分的固定。

（2）因不脫鈣的骨組織標本致密緊實(shí)，應在抽真空負壓的條件下進(jìn)行骨組織標本的脫水、浸潤處理，以使組織標本脫水充分，樹(shù)脂包埋液浸潤更加完全，更利于后續的組織切片制備。

（3）進(jìn)行光聚合固化包埋時(shí)，應先利用干燥滲透聚合裝置抽真空，排凈包埋模具內殘存的氣泡，以免影響組織塊的聚合、固化。

（4）平行粘片制作過(guò)程中應利用磨片機充分對需要觀(guān)察的組織切面拋光處理，以免出現組織切片厚薄不一現象。

（5）在磨片時(shí)，磨盤(pán)轉速應設置的盡可能的低，以免造成植入的骨修復材料與宿主骨組織脫離，致使長(cháng)入骨修復材料的新生骨組織丟失，影響后期的組織病理學(xué)分析。

與普通的石蠟包埋法病理組織切片制備方法不同，本研究采用Technovit 7200 VLC光聚樹(shù)脂進(jìn)行骨組織標本光固化包埋，借助EXAKT 硬組織病理切磨系統制備骨組織標本的不脫鈣病理組織切片，組織切片制備過(guò)程中所用的并不是傳統的病理切片刀，而是鑲嵌有金剛石的無(wú)齒切割帶鋸，以" 鋸" 的形式對組織進(jìn)行切割，制備組織切片。該方法制備的病理切片最顯著(zhù)的特點(diǎn)是不需要對骨組織進(jìn)行脫鈣處理，可使骨組織結構形態(tài)保持完好，骨的礦化結構不被破壞，可用于含金屬、陶瓷、骨水泥等骨修復材料的臨床前安全性和有效性的骨缺損修復動(dòng)物試驗研究[12]。同時(shí)，該技術(shù)方法制片過(guò)程中不需要剔除植入到骨組織中的植入物，保持了骨組織與植入物之間原有的組織結構形態(tài)，可直觀(guān)反應結合界面的組織生長(cháng)結合情況，這對骨缺損修復試驗的組織長(cháng)入研究具有重要意義，可用于3D 打印多孔洞類(lèi)材料組織長(cháng)入等生物組織相容性研究[13]。

生物材料及醫療器械動(dòng)物試驗研究的目的是預測其應用于臨床可能發(fā)生的不良反應，是醫療器械臨床前安全性評價(jià)必須進(jìn)行的一項試驗研究[14]。動(dòng)物試驗研究組織病理學(xué)評價(jià)是該評價(jià)體系中重要的一環(huán)，用以確定產(chǎn)品組織相容性，是評價(jià)其安全性并判定是否可以應用于臨床的重要研究手段[15，16]。樹(shù)脂包埋法制備病理組織切片無(wú)需進(jìn)行脫鈣處理，在動(dòng)物試驗研究中結合動(dòng)物活體親骨熒光素標記技術(shù)，可實(shí)現動(dòng)態(tài)測量骨修復過(guò)程中的新生骨礦化率和礦化速率，進(jìn)行骨形態(tài)計量學(xué)研究[17，18]。制備的病理組織切片最顯著(zhù)的特點(diǎn)是不破壞植入到骨組織中的植入物，保持了骨組織與植入物之間原有的組織結構形態(tài)，該技術(shù)方法結合掃描電鏡技術(shù)，可實(shí)現觀(guān)察成骨細胞在骨修復材料表面及孔隙內附著(zhù)及生長(cháng)情況，從而判斷骨修復程度，同時(shí)結合掃描電鏡技術(shù)可實(shí)現觀(guān)察骨修復材料表面侵蝕及骨質(zhì)沉積情況的研究[19-22]。

20世紀80年代，為研究骨組織的礦化程度及新骨形成情況，塑料包埋技術(shù)開(kāi)始應用于骨組織病理切片的制備，近年來(lái)許多實(shí)驗室在塑料包埋方法上進(jìn)行了創(chuàng )新，特別是在包埋聚合液及其聚合條件方面做了多種改進(jìn)[23-26]。有文獻報道用甲基丙烯酸甲酯（MMA）及鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）為滲透劑，甲基丙烯酸甲酯為包埋劑，包埋聚合制備骨組織塑料包埋切片的技術(shù)方法，但這一制片技術(shù)因操作煩瑣，制作周期長(cháng)，且塑料包埋塊制備過(guò)程復雜，組織切片制備過(guò)程對溫度要求高，目前該技術(shù)方法仍然在用，但未得到廣泛應用[27，28]。本研究制備不脫鈣骨組織病理切片包埋劑采用的是光聚樹(shù)脂，通過(guò)黃光與藍光共同輻照完成組織包埋塊的包埋聚合，與傳統的" 石蠟包埋組織切片" 方法及" 塑料包埋技術(shù)" 組織切片方法制備骨組織病理切片所用的包埋劑不同，組織標本的浸潤處理及切片方式也不同。

本研究制備的含骨修復材料腰椎椎體不脫鈣病理組織切片，光學(xué)顯微鏡下可清晰觀(guān)察骨缺損部位植入骨修復材料后組織結合界面骨的各種組織細胞結構，可進(jìn)行骨缺損修復后骨組織重建進(jìn)程及炎癥反應研究，適用于生物材料及醫療器械臨床前動(dòng)物試驗安全性評價(jià)的組織病理學(xué)研究。

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